La versione a 5 ceppi del test di Ames su piastre Petri

MacroAmes1 Penta 3 – kit pronto all’uso comprendente ceppi (TA98, TA100, TA1535, TA1537, E.coli uvrA[pKM101])

IL TEST

-Valuta il potenziale mutageno di una sostanza chimica/composto/campione.
-Test di mutazione inversa batterica utilizzando mutanti carenti: carente nella sintesi di un aminoacido specifico (Salmonella: istidina, ceppi di E.coli: triptofano).
-Il test di Ames può rilevare sostituzioni di coppie di basi e/o mutazioni frameshift.
-Test di Ames positivo → la sostanza chimica può essere cancerogena.

Il principio alla base del test di Ames

Utilizza ceppi auxotrofici his-Salmonella typhimurium e trp-E. coli: i ceppi portano mutazioni nei geni coinvolti nella sintesi dell’istidina/triptofano e non possono crescere in assenza degli aminoacidi istidina o triptofano.
Sostituzioni di coppie di basi e/o mutazioni frameshift possono correggere (=invertire) questi difetti, che si traducono in batteri prototrofici (=revertanti) che possono sintetizzare istidina/triptofano e crescere in condizioni di nutrienti minime.
Auxotrofico: non in grado di produrre l’amminoacido
Prototrofico: capace di produrre l’amminoacido (=revertante)

Attivazione metabolica utilizzando la frazione epatica S9

Limitazione del sistema batterico: non può metabolizzare sostanze chimiche nello stesso modo in cui lo fa il sistema dei mammiferi (nel corpo umano).
Per imitare il metabolismo dei mammiferi, viene aggiunta la frazione epatica S9
I composti possono diventare mutageni sotto l’azione degli enzimi S9
Il test di Ames viene eseguito senza e con S9.

Interpretazione dei risultati

Incubazione del composto in esame in un terreno carente di aminoacidi (privo di His o Trp).
Vengono aggiunti His o Trp per 1-2 repliche durante l’esposizione per consentire il verificarsi di un numero limitato di eventi mutageni.
Nell’ambiente selettivo solo i revertanti possono crescere.
Il tradizionale test di Ames viene valutato contando le colonie che crescono su piastre di agar con un apporto limitato di aminoacidi.

Test di Ames su agar –  Preparazione delle piastre

La preparazione delle piastre e del soft agar deve essere effettuata da 1 a 4 giorni prima del saggio.

Si aggiunge soft agar al terreno di esposizione.
Autoclavare per 20 minuti a 121°C e raffreddare a 50-60°C per circa due ore.

Portare in agitazione a 50-60°C, e dispensare 25 mL in ogni piastra petri (2 x 42 più 6 piastre petri sterili).

Giorno 1

Cultura Overnight

Giorno 2

Misurazione della densità ottica delle colture O/N miscelazione dei componenti e colata sulle piastre.

Si incuba per 72 ore a 37°C.

Giorno 5

Raccolta dei risultati.

Schema delle piastre agar

Pianificazione del programma consigliato per il test di incorporazione delle piastre

Le piastre rimangono nell’incubatrice per 72 ore.
E’ possibile preparare in anticipo lotti di piastre più grandi (le piastre possono essere conservate a 2-8°C fino a 4 settimane).

CARATTERISTICHE

• kit pronto all’uso comprendente ceppi (TA98, TA100, TA1535, TA1537, E.coli uvrA[pKM101]), fegato di ratto S9, controlli positivi, agar e terreni.
• Pienamente conforme alla OECD TG 471
• Controllo qualità fornito da Xenometrix
• Viene fornito il certificato di analisi per ceppi, terreni, S9 e controlli positivi
• Altri ceppi disponibili: TA97a, TA102, E.coliWP2 uvrA, E.coli WP2 pKM101
• Formazione/Trasferimento tecnologico disponibile in loco o digitale.