Prestazione della frazione microsomiale S9 in Ames II e Ames MPF™: Aroclor 1254 and Phenobarbital/Naphthoflavone

Fegato di ratto S9

Da molti anni distribuiamo la frazione microsomiale di fegato di ratto S9, sia indotta da Aroclor 1254 che da β-naftoflavone e fenobarbital. L’induzione è necessaria per attivare gli enzimi metabolici nel fegato. La metabolizzazione delle sostanze chimiche è importante, perché la maggior parte dei composti chimici diventa mutagena o cancerogena solo dopo la metabolizzazione (stima 80%).

La frazione S9 è la frazione supernatante dopo nove fasi di centrifugazione del fegato di ratto e contiene tutti gli enzimi metabolizzanti xenobiotici microsomiali e citosolici dei mammiferi. Serve come “fegato esterno” per i batteri, in quanto nei batteri mancano tutti questi enzimi dei mammiferi.

I cofattori, tra cui glucosio-6-fosfato (G-6-P) e β-nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADP, per l’ossidazione supportata da NADPH), vengono aggiunti al test mediante l’uso del kit S9 Cofactor.

Poiché l’Aroclor 1254 è stato bandito nel 1977, l’omogenato di fegato di ratto S9 indotto da Aroclor sta scomparendo dal mercato.

Con l’obiettivo di fornire i migliori prodotti agli utilizzatori di Ames II e Ames MPF™, nell’ultimo decennio Xenometrix ha generato un database di risultati per confrontare le prestazioni dell’S9 indotto da Aroclor 1254 e dell’S9 indotto da β-naftoflavone/fenobarbital con ben noti e studiati mutageni che richiedono attivazione metabolica, ad es. 2-amminoantracene (2-AA), 2-amminofluorene (2-AF) e benzo[a]pirene (B[a]P).

L’Aroclor 1254 fegato di ratto S9 è ancora disponibile presso la Xenometrix per studi comparativi (diversi laboratori stanno cercando S9 indotto da Aroclor).

L’S9 indotto da PB/NF è un preparato S9 di alta qualità ed è liofilizzato da un partner altamente specializzato in questa tecnologia. C’è poca differenza nei risultati tra l’S9 indotto da Aroclor 1254 e l’S9 indotto da β-naftoflavone/fenobarbital (questo può dipendere anche dalle classi chimiche utilizzate dai clienti).
I dati di confronto di alcune sostanze chimiche sono forniti nella pagina Database Chemicals di Xenometrix.

Dati a confronto di alcune sostanze chimiche

Alcune sostanze chimiche (ad es. ammine aromatiche o idrocarburi policiclici aromatici) sono biologicamente inattive, ma diventano mutagene in seguito alla metabolizzazione, spesso mediata dal sistema di ossidazione metabolica basato sul citocromo P450. Questo sistema è presente nell’uomo e negli animali inferiori (principalmente nel fegato), ma assente nei batteri.

Un sistema esogeno di attivazione di organi di mammifero deve quindi essere incluso nel test di Ames e, per la maggior parte, il sistema metabolico è prelevato da roditori.

L’S9 è prodotto dai fegati di ratto o criceto che sono stati trattati con sostanze che causano una forte induzione di molti enzimi metabolizzanti xenobiotici. Storicamente, tale sostanza è stata spesso l’Aroclor 1254 ma sono stati utilizzati anche il β-naftoflavone e il fenobarbital.

Un omogenato di fegato viene successivamente centrifugato a 9000 g. Il supernatante risultante, generalmente indicato come S9, contiene microsomi e citosol, e quindi tutti gli enzimi metabolizzanti xenobiotici microsomiali e citosolici.
Vengono aggiunti al sistema altri cofattori, tra cui glucosio-6-fosfato (G-6-P) e β-nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (per l’ossidazione supportata da NADPH).

Come altre miscele commerciali di policlorobifenili, gli Aroclor sono stati vietati nel 1977, queste miscele si sono rivelate tossiche per l’uomo (con alto bioaccumulo nel tessuto adiposo) e hanno una lunga persistenza ambientale. Di conseguenza, i lotti di omogenato di fegato di ratto S9 indotto da Aroclor sono destinati ad esaurirsi.

La Xenometrix, nel tentativo di fornire i migliori prodotti agli utilizzatori di Ames II e Ames MPF ™, ha generato un database di risultati nell’ultimo decennio per confrontare le prestazioni dell’S9 indotto da Aroclor 1254 e dell’S9 indotto da β-naftoflavone/fenobarbital con mutageni ben noti e studiati che richiedono attivazione metabolica, 2-amminoantracene (2-AA), 2-amminofluorene (2-AF) e benzo[a]pirene (B[a]P).

I valori medi e di deviazione standard per le risposte alla dose per l’S9 Aroclor 1254 indotto e per l’S9 indotto da PB/NF sono mostrati rispettivamente in grigio e rosa.

Conclusioni
Questi risultati suggeriscono che i dati generati con S9 Aroclor 1254 indotto e S9 indotto da PB/NF sono essenzialmente identici.