I SUBSTRATI CROMOGENICI

Che cosa sono e perchè ne abbiamo bisogno?

La parola deriva dal greco (Chroma=Colore) e indica un substrato che genera colore.
Sono normalmente dei peptidi formati da 3-5 residui legati a molecole cromofore. Il cromoforo è la p-nitroanilina (p-NA) e i residui possono essere aminoacidi naturali o amminoacidi chimicamente modificati.
La sequenza dei residui imita la sequenza del substrato naturale. L’idrolisi del substrato provoca il rilascio di pNA (composto di colore giallo). Reazione enzimatica.

ENZIMI – PROTEASI

Gli enzimi sono proteine che catalizzano le reazioni chimiche:

• Esercitano la sua attività catalitica sui substrati
• Gli enzimi proteolitici agiscono sui loro substrati naturali, le proteine, idrolizzando uno o più legami peptidici
• Il processo di idrolisi è solitamente altamente specifico poiché vengono scissi solo i legami peptidici adiacenti a determinati amminoacidi.

CLASSI DI PROTEASI
NOME                                       SITO ATTIVO
Serin proteasi                             Ser His Asp*
Cistein proteasi                          Cys His Asp*
proteasi ad aspartato                  Asp Asp
Metalloproteasi                          His His Zn2+
*Asp non sempre presente

BREVI CENNI STORICI

L’applicazione di substrati cromogeni nell’emostasi iniziata nei primi anni ’70.

• BAPNA è stato il primo substrato cromogeno per la serina proteasi ma con scarsa selettività.
• S-2160 è stato il primo substrato di trombina cromogenico.
• Tra i 500 peptidi pNA sintetizzati, 24 sono risultati avere la migliore specificità e reattività nei confronti degli enzimi studiati.
  Ora, la nostra gamma di prodotti copre ampiamente le esigenze dei clienti.

LA STRUTTURA CHIMICA

Substrato naturale

Peptide con sito di scissione specifico per proteasi specifica

 

 

 

 

SUBSTRATO SPECIFICO PER FXa

– Cod. 30803 – CHROM-22 – SUBSTRATO SPECIFICO PER FXa

Struttura: Bz-Ile-Glu (γOCH3)-Gly-Arg-pNa and Bz-Ile- Glu (γOH)Gly-Arg-pNa
Peso molecolare: 711.8 Da ( 1) and 697.7 Da ( 2)
Km (mM): 1,1
kcat (1/s): 100

 

kcat è il numero di turnover e corrisponde a k3. È il numero massimo di molecole di substrato che può essere convertito in prodotto per unità di tempo.
Km corrisponde alla concentrazione di substrato che dà una velocità di reazione di Vmax/2.

APPLICAZIONI DEI SUBSTRATI CROMOGENICI SINTETICI

Enzimi attivi (saggio della trombina)

CHROM-38 – Substrato cromogenico trombina per la determinazione dell’attività anti-FIIa di LMWH e UFH in accordo con la Farmacopea Europ./US.
Altamente purificato e stabilizzato.
Come agente di carica: Mannitolo
Molarità: 45 μmol/flaconcino.

Principio:

Enzimi non attivi (zimogeni)

CHROM-65 – Substrato cromogenico Factor Xa per il controllo di qualità dell’attività anti-FXa delle eparine in accordo con Europ./US Pharmacopoeia.
Altamente purificato e stabilizzato.
Come agente di carica: Mannitolo
Molarità: 39 μmol/flaconcino.

Principio:

Inibitori

L’antitrombina è il principale inibitore della trombina, responsabile circa l’80% dell’attività inibitoria della trombina nel plasma.

Sia la farmacopea europea che quella statunitense descrivono saggi cromogeni anti-FIIa e anti-FXa nelle loro monografie per l’eparina non frazionata (UFH) e l’eparina a basso peso molecolare (LMW).
I metodi per l’UFH sono in EP e USP da gennaio 2016.
Sono disponibili standard internazionali per l’UFH e l’MWH
I reagenti sono gli stessi per tutti i metodi, ma vi sono delle piccole differenze nelle concentrazioni e nei tamponi utilizzati. La maggior parte dei metodi sul mercato non sono conformi al 100% con la Farmacopea.
L’FXa o l’FIIa viene incubato in eccesso con una miscela di eparina e Antitrombina. L’enzima residuo viene misurato dopo un tempo di incubazione standardizzato con un substrato cromogenico.

Saggi cromogenici di attività del cofattore dell’eparina: Anti-IIa

Antitrombina: Anti-Xa

PRODOTTI

I Reagenti per la determinazione delle attività anti-FIIa e anti-FXa di UFH e LMWH sono conformi con le Farmacopee europee e statunitensi.
Puoi selezionare i singoli componenti necessari per i saggi o avvalerti degli STARTER SET completi di bioreattivi e tamponi.
Forniamo procedure standardizzate con istruzioni dettagliate per l’uso e supporto tecnico.

I reagenti

– 60230 – Enzima. Trombina (Umana). Flaconcino da 100 IU.
– 60217 – Enzima. Factor Xa (Bovino). Flaconcino da 30 μg.
– 60104 –  Proteina. Antitrombina ( Umana). Flaconcino da 10 IU.
– 60237 – Enzima. Trombina (bovino). Flaconcino da 21 IU.
– 30805 – CHROM 38 –  Substrato cromogenico Trombina. Flaconcino da 25 mg.
– 30807 – CHROM 65 –  Substrato cromogenico Factor Xa. Flaconcino da 25 mg.

I Buffer

-Polvere in sacchetti
-Volumi maggiori
-Pronto all’uso una volta ricostituito
-Composizione esatta come nelle Farmacopee

– 80433 – BUFFER USP/Ph.Eur. Tris-NaCl-BSA Buffer salts pH 7.4. 1000 ml
Il contenuto di una busta disciolta in 1000 mL in acqua deionizzata:
0.050 M Tris Buffer pH 7.4
0.150,M,NaCI
1.0%,(w/v) BSA (bovine serum albumin).

– 80432 – BUFFER USP Tris-NaCl-PEG-6000 Buffer salts pH 7.4. 1000 ml
Il contenuto di una busta disciolta in 1000 mL in acqua deionizzata:
0.050 M Tris Buffer pH 7.4
0.150 M NaCI 0.1% (w/v) PEG-6000.

– 80430 – BUFFER USP Tris-NaCl Buffer salts pH 7.4. 1000 ml
Il contenuto di una busta disciolta in 1000 mL in acqua deionizzata:
0.050 M Tris,Buffer pH,7.4
0.150 M NaCI.

– 80431 – BUFFER USP/Ph.Eur. Tris-NaCl-EDTA Buffer salts pH 8.4. 500 ml
Il contenuto di una busta disciolta in 500 mL in acqua deionizzata:
0.050 M Tris Buffer pH 8.4 at 25°C
0.175 M NaCI
0.0075 M EDTA

– 80434 – BUFFER USP/Ph.Eur. Tris-NaCl-EDTA-PEG-6000 Buffer salts pH 8.4. 1000 ml
Il contenuto di una busta disciolta in 1000 mL in acqua deionizzata:
0.050 M Tris Buffer pH 8.4
0.175 M NaCI
0.0075 M EDTA
0.1% (w/v) PEG-6000

Starter Set

– 90455 – TEST USP-LMWH Anti-IIa starter set.
– 90456 – TEST USP-LMWH Anti-Xa starter set.
– 90457 – TEST USP-UFH Anti-IIa starter set.
– 90458 – TEST USP-UFH Anti-Xa starter set.
– 90451 – TEST EP-LMWH Anti-IIa starter set.
– 90452 – TEST EP-LMWH Anti-IIa starter set.
– 90453 – TEST EP-UFH Anti-IIa starter set.
– 90454 – TEST EP-UFH Anti-Xa starter set.

Cofattori

Importanza del Fattore VIII

Case farmaceutiche:
CQ sui prodotti iniettabili (FVIII: concentrati, purificati e ricombinanti)

Diagnostica:
Laboratori di emofilia (bassi livelli di rischio di sanguinamento)
Laboratori di trombofilia (livelli elevati a trombotica rischio)
Laboratori di routine (screening dei fattori)

Principio del cromogenico Fattore VIII

 

 

 

 

 

 

BIA- Biological Immuno Assay

Saggio immunologico biologico
• Combinazione di tecnica immunologica (tipo Elisa) e saggio biologico.

Esempio di t-PA activity