Problemi spesso riscontrati dal cliente con gli IB Self Contained
Spesso vengono poste domande sul colore dei terreni contenuti all’interno degli indicatori biolgici self-contained.
Gli indicatori biolgici identificati con il termine Sel-contained, sono sistemi chiusi contenenti sia le spore inoculate su un supporto che può essere di carta o di acciaio e un terreno di coltura con formulazione particolare contenente un pH di viraggio che permette all’utilizzatore di vedere visivamente se il processo di sterilizzazione è stato efficace o meno.
La principale caratteristica di questi self-contained, oltre ad essere un sistema chiuso pratico e protetto da eventuale contaminazione esterna, è quella di rilasciare rapidamente i risultati di avvenuta sterilizzazione.
Se gli indicatori biologici self-contained vengono utilizzati seguendo le istruzioni fornite dal produttore in conformità con gli Standards ISO 11138, vi è certezza sul loro lavoro ottimale e sul risultato che forniscono.
In caso contrario, si possono creare delle fastidiose problematiche: vediamo alcuni casi:
Caso 1: Self-contained in fiala di vetro da 1 ml ( AT-0X) da 0,7 ml (ATM-0X) per i processi di sterilizzazione a vapore dei carichi liquidi.
Il terreno contenuto in questi due prodotti è identico tranne per il volume usato. Il normale viraggio del colore va dal viola al giallo.
Alcuni clienti hanno riscontrato un colore “brunastro” per alcune fiale dopo ciclo di sterilizzazione a causa della conseguente esposizione al calore .
Una volta che l’indicatore biologico ad ampolla è stata autoclavata in un ciclo tipico monitorato, viene incubata per vedere se tutte le spore sono morte o se alcune sono sopravvissute al ciclo. Questo test di crescita/non crescita viene valutato osservando il colore e la chiarezza del TSB all’interno dell’ampolla.
Le fiale contengono anche un indicatore di pH che conferisce al TSB un colore viola.
Dopo l’incubazione, se le spore non sono state uccise nel ciclo, germineranno in cellule vegetative, metabolizzeranno il TSB e inizieranno a crescere.
Nell’ambito del metabolismo degli zuccheri presenti nel TSB vengono rilasciati prodotti di scarto acidi e conseguentemente il colore della fiala cambia dal viola al giallo per effetto dell’abbassamento del pH.
Secondo le indicazioni del produttore, gli IB devono essere sterilizzati a 121°C per 15 minuti. Questo parametro di tempo e temperatura per la sterilizzazione è molto chiaro in USP(.
Quindi 15 minuti a 121°C significano che il fluido viene mantenuto a 121°C per 15 minuti interi. Considerando che un tempo di salita potrebbe essere di 20 minuti, l’intero ciclo sarebbe impostato a 35 minuti: venti minuti per la salita e altri 15 minuti a 121°C.
Cicli con temperature più elevate di 121°C o con tempo di esposizione superiore a 15 minuti, possono in un modo o nell’altro causare uno scurimento naturale o una caramellizzazione di colore marrone del terreno causato dalla presenza del glucosio e altri zuccheri presenti nel mezzo di crescita che a lungo si scuriscono. Questo è un evento dovuto semplicemente all’esposizione del terreno a cicli di calore estesi o superiori diversi da quelli specificati dal produttore e alla presenza fisica di un indicatore di pH di colore viola.
Le fiale contengono anche un indicatore di pH viola per facilitare all’utente la determinazione della crescita all’interno della fiala. Se il BI non è stato ucciso nel ciclo di sterilizzazione, al momento dell’incubazione le spore sopravvissute metabolizzano gli zuccheri, rilasciano rifiuti acidi e quando il pH scende di conseguenza, l’indicatore del pH cambia il colore dell’ampolla da viola a giallo.
Se si verifica una leggera caramellizzazione durante la sterilizzazione in autoclave, la fiala sembrerà di colore più scuro di quanto ci si aspetterebbe e più scura rispetto a una fiala non trattata.
Questo è il motivo per cui una fiala di controllo negativo dovrebbe essere sempre utilizzata. La fiala di controllo negativo viene posizionata insieme alle fiale di prova e può essere utilizzata come riferimento futuro del colore di quale sarà il normale colore della fiala “processata” quando verrà rimossa dall’autoclave.
Dopo l’incubazione, un’ampolla che sta dimostrando la crescita cambierà ulteriormente di colore in o verso un colore miele o giallo e mostrerà torbidità. Questo cambiamento di colore aggiuntivo può essere facilmente notato quando viene confrontato con il colore di una fiala di controllo elaborata.
La caramellizzazione del terreno durante l’esposizione non compromette la capacità del supporto di promuovere la crescita e di fornire dati utili sui test di sterilizzazione.
Caso 2: Self-contained con fiala e tappo con filtro in polipropilene (MSCEA-0X) per processo di sterilizzazione ad ossido di etilele (EO). La fiala contiene un disco inoculato con le spore di B.atrophaeus e un ampollina con terreno di coltura modificato e pH di viraggio. Il tappo presenta dei fori per permettere al gas di penetrare all’interno della fiala durante il processo di sterilizzazione. A fine sterilizzazione, il sistema viene attivato rompendo la fialetta di vetro contenete il terreno che andrà a bagnare il disco inoculato. Successivamente deve essere incubato per un massimo di 72 ore a 35-40°C.
Viraggio del colore da verde a giallo.
A.L’indicatore biologico era inizialmente positivo (giallo) ma poi è diventato negativo (verde) con un’incubazione prolungata.
Come affermato in precedenza, tutti gli indicatori biologici vengono utilizzati nello stesso modo generale: il BI viene sterilizzato, attivato e quindi successivamente incubato nell’intervallo di crescita favorevole alle specie di spore specifiche.
Con la maggior parte delle specie batteriche, la germinazione e la proliferazione iniziali sono dovute ai carboidrati (zuccheri) presenti all’interno del mezzo di crescita che forniscono una fonte di energia.
Il sottoprodotto del metabolismo dei carboidrati è acido. Alcune specie hanno anche la capacità di metabolizzare le proteine come fonte di energia; il sottoprodotto del metabolismo delle proteine è basico.
La specie di spore presente all’interno del nostro prodotto MSCEA-0X è il Bacillus atrophaeus che ha la capacità di metabolizzare sia i carboidrati che le proteine.
Gli zuccheri semplici sono molto più facili da metabolizzare. Pertanto, in un ambiente in cui sono disponibili abbondanti carboidrati e proteine, i microbi metabolizzeranno sempre i carboidrati per primi.
Nel caso di questo cliente, le spore sono sopravvissute al ciclo, sono germinate e le cellule risultanti hanno inizialmente metabolizzato i carboidrati presenti nel terreno, da qui il colore giallo del mezzo che indica un’unità positiva.
Con l’incubazione prolungata e l’esaurimento dei carboidrati, le cellule hanno quindi iniziato a metabolizzare le proteine all’interno del mezzo, con il risultato che il mezzo è diventato basico.
Il supporto inizialmente è cambiato da giallo a verde chiaro (che è il colore originale del supporto all’interno di questo prodotto e normalmente significherebbe un risultato negativo) e progressivamente è passato a un colore magenta o rosa brillante. Un attento esame del mezzo a questo punto dovrebbe confermare anche la torbidità o la crescita all’interno dell’ampolla.
Abbiamo progettato un indicatore biologico apposito per i cicli di incubazione prolungati, per fornire carboidrati abbondanti in modo tale che nella maggior parte dei casi le cellule muoiano a causa della diminuzione del pH prima di tornare al metabolismo delle proteine.
B. .L’indicatore biologico mostra un colore verde/giallo con un’incubazione prolungata.
All’interno del sistema la fiala di vetro contiene una piccola quantità di liquido. Se si seguono le istruzioni del produttore e si incuba per un determinato tempo che non supera le 72 ore, il sistema lavorerà bene e con un corretto viraggio.
Se si prolunga il periodo di incubazione può accadere che il terreno evapora e i componenti rimanenti si concentrano, il che influisce sul colore.
Il nostro TDS per MSCEA-0X sottolinea che se l’incubazione è richiesta per più di 72 ore, l’indicatore biologico self contained deve essere tappato o sigillato per evitare l’evaporazione del supporto. Il cliente potrebbe “sigillare” gli SCBI con parafilm o nastro adesivo.
Al contrario, il cliente con l’esigenza di prolungare il tempo di incubazione potrebbe anche utilizzare il prodotto dal codice SCEA-0X, self contained rigido che si attiva premendo il cappuccio verso il basso fino a quando non si trova sopra l’ampolla contenente terreno e la rompe. Il design di questo indicatore è tale che la velocità di evaporazione è molto più lenta dato che il tappo aiuta a “sigillare” la fiala.
Caso 3: Self-contained con fiala e tappo con filtro in polipropilene (MSCST-0X) per processo di sterilizzazione a vapore dei carichi asciutti.
L’ BI è diventato giallo ma non sono presenti spore dopo la subcoltura.
Il cliente dovrebbe conoscere quali processi biochimici avvengono all’interno di un BI positivo.
Rappresentiamo con il grafico quanto accade al suo interno:
Il grafico si ottiene riportando
– sull’asse delle x il tempo
– sull’asse delle y il logaritmo del numero di unità formanti colonia.
1) Inizialmente abbiamo una fase di latenza o Lag. I batteri si devono adattare al nuovo ambiente e non aumentano.
2) Sussegue poi la fase della crescita esponenziale o log o trofofase nella quale il consumo dei nutrienti e delle fonti energetiche e strettamente correlato con l’aumento del numero delle cellule.
3) Arriva poi la fase stazionaria o idiofase e il sistema entra in equilibrio. Le nuove cellule sostituiscono quelle morte e questo accade perche iniziano a scarseggiare i nutrienti mentre si accumulano le sostanze di rifiuto.
4) Il processo termina con la fase di declino, nella quale troviamo le cellule morte e sostanze di rifiuto.
Nella fase stazionaria, a causa dell’accumulo di metaboliti acidi e dell’esaurimento dei nutrienti disponibili, le cellule iniziano a morire quando l’ambiente diventa tossico a causa dei loro stessi rifiuti metabolici.
È per questo motivo che la subcultura di un BI positivo deve essere eseguita immediatamente dopo aver notato che l’unità è positiva. Nel caso di questo cliente, il positivo è stato rilevato a 24 ore, tuttavia, l’unità ha continuato a incubare per 72 ore e non è stata sottoposta a subcoltura fino a quel momento.
Quando è stato piastrato su una piastra di agar (TSA) e incubato, non sono state trovate colonie. Ciò era dovuto al fatto che le cellule vitali non erano più presenti all’interno del terreno.