MNT – Micronucleus Test, Test Citogenetici
MicroNucleus Test MNT In Vitro (OECD TG487)
Principio del test
Il test in vitro dei Micronuclei MNT è uno dei test più efficaci e affidabili per la rilevazione di sostanze chimiche con potenziale genotossico. Le sostanze chimiche o gli agenti fisici possono generare cromosomi acentrici (evento clastogeno) o segregare in modo inappropriato interi cromosomi (evento aneugen) portando a danni genetici sotto forma di un nucleo irregolare e più piccolo chiamato micronucleo.
Possono essere progettati sia studi in vitro che in vivo.
Il primo viene generalmente eseguito utilizzando linee cellulari di mammiferi, tipicamente dopo la somministrazione di elementi di prova (sostanze chimiche o miscele).
Il test del micronucleo in vivo viene eseguito su cellule del sangue periferico per la ricerca citogenetica e le indagini sugli effetti genotossici delle radiazioni e dell’irradiazione.
Le caratteristiche del micronucleo consentono di identificare il meccanismo d’azione quando vengono applicate le sonde FISH. Queste informazioni sono molto importanti per comprendere appieno i dettagli biologici dell’agente genotossico e progettare studi di follow-up per affrontarli.
Il test del micronucleo è descritto nella OECD TG487. In breve, le cellule di mammifero vengono coltivate in modo esponenziale durante il trattamento fino alla raccolta. Le cellule devono trovarsi nelle varie fasi dei loro cicli cellulari e devono essere sottoposte ad almeno 1,5-2 cicli cellulari durante l’esposizione con la sostanza chimica in esame.
I programmi di trattamento per diverse linee cellulari, colture cellulari primarie o linfociti possono variare.
La maggior parte degli aneugeni e dei clastogeni possono essere rilevati durante un periodo di trattamento da 3 a 6 ore in assenza o presenza di attivazione metabolica da parte della frazione microsomiale del fegato di ratto S9.
Dopo l’esposizione, il terreno, S9 (se aggiunto) e il composto in esame vengono rimossi, viene aggiunto un terreno fresco e le cellule vengono incubate per un tempo di 1,5 – 2 cicli cellulari.
Le colture cellulari vengono raccolte individualmente e le cellule vengono preparate per la installazione dei vetrini (trattamento ipotonico o diffusione cellulare).
Varie tecniche possono essere utilizzate per colorare i Micronuclei, ad es. Giemsa o coloranti specifici per la colorazione del DNA.
Alcuni coloranti fluorescenti specifici possono eliminare alcuni degli artefatti associati alla colorazione non specifica del DNA: anticorpi anti-cinetocore o FISH con sonde di DNA pancentromeriche insieme a un’appropriata colorazione di contrasto del DNA (DAPI), possono essere utilizzati per identificare il contenuto dei micronuclei se le informazioni meccanicistiche sono necessarie.
Anche l’analisi delle immagini o la citometria a flusso possono fornire informazioni utili.
Si noti che la perdita di cromosomi non viene rilevata nel test di aberrazione cromosomica.
Descrizione MNT utilizzando sonde FISH – Rapid MicroNucleus MoA
Le sonde FISH e una serie di soluzioni accuratamente ottimizzate consentono di rilevare centromeri e telomeri nelle cellule umane in modo sensibile, utilizzando sia linee cellulari che ex vivo, in appena 1 ora.
Questo è possibile grazie al nostro kit pronto per l’uso, il Rapid Micronucleus MoA Test.
Le cellule sono preparate secondo i protocolli standard della OECD TG 487 e i vetrini vengono trattati sequenzialmente con una serie di soluzioni fornite con il kit “Rapid Micronucleus MoA”, tra cui una sonda centromerica specifica per l’uomo, altamente sensibile e una soluzione di controcolorazione contenente DAPI ( 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindolo).
Dopo il trattamento, i vetrini vengono lavati in sequenza seriale con PBS ed etanolo. All’area di interesse vengono quindi aggiunti 20 µl della sonda centromerica e il vetrino viene riscaldato a 80 ° C per 3 minuti e trasferito in una camera umidificata per 20 minuti.
Seguono i lavaggi e una fase di controcolorazione di 5 minuti prima dell’aggiunta della soluzione di montaggio.
Utilizzando un obiettivo di ingrandimento 40X, sarà possibile identificare facilmente i micronuclei e valutare se è presente un centromero.
La lettura e l’archiviazione automatizzate possono essere ottenute con i sistemi di scansione dei vetrini, ad es. Metafer.
Le diapositive sono generalmente pronte per la valutazione entro 1 ora.
Biomonitoraggio dell’esposizione a basse dosi di radiazioni – Test del micronucleo-centromero basato su FISH
La tecnologia della sonda FISH utilizzata nel kit Rapid Micronucleus MoA Test, oltre ad essere utilizzata per la dosimetria fisica, può essere utilizzata anche nell’analisi citogenetica, ovvero in persone esposte a radiazioni cliniche o naturali.
PROTOCOLLI
Preparazione delle cellule
Protocollo di Ibridazione
Valutazione della citotossicità (dose massima: 45+/- 5% Indice di replicazione / Raddoppio della popolazione) Rapid Micronucleus MoA.
Preparazione dei vetrini
- Immergere i vetrini in PBS per due minuti
- Immergere i vetrini in in serie refrigerata (4 ° C) di etanolo (50%, 70%, 100%) per 2 minuti ciascuno.
- Lasciare i vetrini in verticale fino a quando non si asciugano
- Aggiungere 20 µ L di sonda centrometrica nell’area di interesse
- Evitando di lasciare bolle, coprire l’area di interesso con il coprivetrino
- Posizionare i vetrini in un blocco riscaldante preriscaldato a 80°C per 3 minuti
- Posizionare i vetrini in una cavità umidificata per 20 minuti*
*: l’ibridazione può essere estesa a 30-40 minuti per avere un segnale più robusto
Protocollo di risciacquo
- Rimuovere il coprivetrino delicatamente
- Immergere i vetrini per 3 lavaggi in soluzione di lavaggio per 2 minuti ciascuno.
Protocollo di contrasto
- Immergere i vetrini nella soluzione DAPI
- Immergere i vetrini in PBS
- Applicare una o due gocce di Mounting Solution per ogni vetrino e posizionare un coprivetrino in vetro 24 × 60 mm
Commenti tecnici
- Leggere attentamente le Istruzioni per l’uso prima di iniziare a lavorare in laboratorio
- La presenza di bolle tra il microfilm e il vetrino comprometterà l’ibridazione!
- La sonda Centrometrica, la soluzione diluente di contrasto DAPI e la soluzione di montaggio sono soluzioni sensibili alla luce: conservare al buio!
- La soluzione diluente di contrasto DAPI è stabile per 6 mesi a -20 ° C o per 1 mese a 2-8° C.